Серологическая диагностика — это совокупность методов, основанных на иммунно-химическом взаимодействии антигена (Аг) и антитела (Ат). Биохимическая суть этих реакций заключается в специфическом узнавании и обратимой связи между эпитопом Аг и активным центром (паратопом) Ат с образованием иммунного комплекса (ИК), который визуализируется различными способами.

1. Биохимическая основа: взаимодействие антиген-антитело

• Специфичность: Обусловлена комплементарностью пространственной структуры эпитопа (3-10 аминокислот или моносахаридов) и антиген-связывающего участка Fab-фрагмента антитела. Взаимодействие обеспечивается нековалентными связями:

  • Водородные связи

  • Электростатические (ионные) взаимодействия

  • Ван-дер-ваальсовы силы

  • Гидрофобные взаимодействия

• Авидность и аффинность:

  • Аффинность — термодинамическая прочность связи одного паратопа с одним эпитопом.

  • Авидность — общая прочность связи многовалентного Ат с многовалентным Аг за счет образования множества связей. Это ключевое свойство, определяющее необратимость преципитации или агглютинации.

2. Основные типы серологических реакций и их биохимическая суть

I. Реакции, основанные на образовании крупных видимых агрегатов (агрегационные)

1. Реакция агглютинации (РА)

   • Многовалентные Ат (чаще IgM, т.к. он пентамерный) связывают корпускулярные Аг (целые клетки: бактерии, эритроциты, латексные частицы с сорбированным Аг), образуя сетевую структуру — агглютинат.

   • Варианты:

     • Прямая РА: Для выявления Ат в сыворотке пациента к известным корпускулярным Аг (диагностикумы).

     • Непрямая (пассивная) РА (РПГА): На поверхности эритроцитов или латекса пассивно сорбированы растворимые Аг. Используется для выявления Ат. Обратная РПГА — для выявления Аг известными Ат.

     • Реакция Кумбса (антиглобулиновый тест): Обнаружение неполных (блокирующих) антител (обычно IgG), которые связываются с Аг на эритроцитах, но не вызывают агглютинации из-за малого размера. Добавление антитела против человеческого IgG (антиглобулиновая сыворотка) приводит к агглютинации. Прямая проба — для выявления Ат на эритроцитах пациента; непрямая — для выявления Ат в его сыворотке.

2. Реакция преципитации (РП)

   • Взаимодействие растворимых многовалентных Аг с многовалентными Ат в растворе или геле с образованием нерастворимого трехмерного решетчатого комплекса — преципитата.

Биохимическая суть: Аг-Ат взаимодействие фиксируется за счет химической метки, присоединенной к одному из компонентов. Высокая чувствительность.

1. Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA)

   • В качестве метки используется фермент (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза). Реакция Аг-Ат выявляется путем добавления хромогенного субстрата, который фермент превращает в окрашенный продукт. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации аналита.

   • Ключевые варианты:

     • Прямой ИФА: Антиген иммобилизован, к нему добавляют специфическое Ат с ферментной меткой.

     • Непрямой ИФА (наиболее частый): Иммобилизованный Аг + сыворотка пациента (первичные Ат) + антивидовые Ат с ферментной меткой (вторичные Ат).

     • Сэндвич-ИФА: Для выявления Аг. Используются два разных Ат: одно иммобилизовано (ловит Аг), второе — с меткой (детектирует Аг).

     • Конкурентный ИФА: Для выявления малых молекул (гаптенов). Аг пациента и меченый стандартный Аг конкурируют за ограниченное количество иммобилизованных Ат.

2. Иммунофлюоресцентный анализ и иммунохемилюминесцентный анализ (ИХЛА)

   • Метка — флюорохром (FITC, флоресцеин; TRITC, родамин). Реакция выявляется под флуоресцентным микроскопом (прямой/непрямой метод) или в анализаторах (флюориметрия).

   • ИХЛА: Метка — хемилюминофор (акридин, изолюминол). При окислении метки испускается фотон света, который регистрируется люминометром. Наиболее чувствительный метод.

   • Иммуноблоттинг (Вестерн-блот): Комбинация электрофореза и ИФА. Белки разделяют в геле, переносят на мембрану (блот), выявляют специфическими мечеными Ат.

3. Радиоиммунный анализ (РИА)

   • Исторически первый высокочувствительный метод. Метка — радиоизотоп (¹²⁵I, ³H). Используется принцип конкурентного связывания. Из-за сложности работы с радионуклидами вытесняется ИФА и ИХЛА.

III. Реакции, основанные на активации комплемента

• Реакция связывания комплемента (РСК)

  • Комплекс Аг-Ат активирует систему комплемента по классическому пути, что приводит к лизису клеток-индикаторов (эритроцитов барана, сенсибилизированных Ат). Если в тестовой системе есть специфическая пара Аг-Ат, комплемент связывается и расходуется → лизиса индикаторных эритроцитов не происходит (положительная реакция). Если пары нет, свободный комплемент лизирует индикаторные клетки (отрицательная реакция). Сложная двухэтапная реакция.