СЛОЖНЫЕ БЕЛКИ. Практическое занятие кафедры биохимии

Сложные белки - группа протеинов, особенностью которых является наличие помимо полипептидной цепочки (последовательности аминокислот, соединенных пептидными связями), простетической группы, т.е. небелкового компонента. В зависимости от состава, сложные белки делят на:
1. Липопротеины (простетическая группа - липиды). ЛПНП, ЛПОНП, ЛППП, ЛПВП, ХМ - являются транспортными формами гидрофобных липидов в организме, причем транспортируют как экзогенные липиды, так и эндогенные. Среди липопротеинов выделяют атерогенные и антиатерогенные частицы. Первая группа представлена ЛПОНП, ЛПНП, ЛППП и ХМ. Из-за высокого содержания липидного компонента в составе гидрофобного ядра данных частиц, высокая концентрация и последующее накопление могут оказаться ведущими факторами в развитии атеросклероза. ЛПВП, относящиеся к антиатерогенным частица, напротив, содержат большое количество апопротеинов, что позволяет им удалять излишек липидов. Это обеспечивает снижение риска развития атеросклероза.
2. Гликопротеины (простетическая группа - углеводы). Простетическая группа гликопротеинов может быть присоединена N-гликозидной связью (через амидную группу аспарагина) или О-гликозидной связью (через гидроксильную группу серина, треонина, гидроксилизина). Гликопротеины участвуют в клеточной адгезии и взаимодействии клеток (интегрины, кадгерины), иммунном ответе (АТ, МНС-молекулы, цитокины), гормональной регуляции (эритропоэтин, ХГЧ), механической защите (муцин), транспорте веществ (трансферрин, церулоплазмин), а также являться рецепторами (гормональные рецепторы).
3. Фосфопротеины (простетическая группа - ковалентно связанные остатки фосфорной кислоты). Остатки фосфорной кислоты чаще всего присоединяются к остаткам серина, тирозина, реже - гистидина и аспарагиновой кислоты. Среди функций фосфопротеинов можно выделить регуляцию активности ферментов за счет участия в реакция фосфорилирования/дефосфорилирования киназ или фосфатаз, участие в передаче клеточных сигналов, процессах транскрипции и трансляции (некоторые факторы транскрипции, например, р53, регулируется фосфорилированием, некоторые фосфопротеины играют структурную роль, как, например, казеин, служащий источником фосфатов. 
4. Металлопротеины (простетическая группа - ионы металлов). Внутренняя классификация металлопротеинов основана на металле, который они содержат: например, железосодержащие цитохромы участвуют в реакциях электронтранспортной цепи, а цинкосодержащие карбоандгидраза и алкогольдегидрогеназа участвуют в ферментативных реакциях превращения углекислого газа в угольную кислоту и окислении этанола соответственно.
5. Хромопротеины (простетическая группа - пигменты). Гемоглобин и миоглобин, содержащие в качестве пигмента красный гем, участвуют в транспорте газов, а родопсин, содержащие каратиноиды - в акте зрения.
6. Нуклеопротеины (простетическая группа  - нуклеиновые кислоты). Среди ДНК-содержащих нуклеопротеинов можно выделить хроматин (ДНК+гистоны), необходимый для укладки генома в эукариотических клетках, к РНК-содржащим нуклеопротеинам можно отнести рибосомы (рРНК+рибосомальные белки), необходимые для синтеза белка.
Цель практического занятия - открытие составных частей фосфо- и нуклеопротеинов в соответствующих гидролизатах качественными реакциями для доказательства природы этих сложных белков.

  • Кислотный гидролиз нуклеопротеинов дрожжей и определение их состава.
В заранее приготовленном гидролизате нуклеопротеинов дрожжей первым делом открывают белковый компонент биуретовой пробой (в сильно щелочной среде в присутствии сернокислой меди образуются комплексные соединения меди с пептидной группировкой): к 5 каплям гидролизата прибавляют 10% раствор едкого натра до щелочной реакции (примерно 10 капель) и по каплям раствор медного купороса до появления розово-фиолетовой окраски, что свидетельствует о наличии  пептидных связей. На пуриновые основания нуклеотидов проводят серебряную пробу: к 10 каплям гидролизата добавляют раствор аммиака до щелочной реакции на лакмус, после чего прибавляют 5 капель аммиачного раствора азотнокислого серебра. Бурый осадок серебряных соединений пуриновых оснований свидетельствует о наличии азотистых оснований в гидролизате. Углеводный компонент открывают пробой Троммера: 10 капель гидролизата нейтрализуют раствором едкого натра, затем добавляют равный объем 10% раствора едкого натра и по каплям 1% раствор сернокислой меди до образования не исчезающей при взбалтывании голубой мути гидрата окиси меди. Затем верхнюю часть пробирки нагревают до кипения, что приводит к  появлению желтого осадка гидрата закиси или кирпично-красный осадок закиси меди. Фосфорную кислоту открывают молибденовой пробой: к 10 каплям гидролизата прибавляют равный объем молибденовокислого аммония в азотной кислоте и кипятят несколько минут. После последующего охлаждения пробирки наблюдают выпадение лимонно-желтого кристаллического осадка комплексного соединения фосфорномолибденовокислого аммония, свидетельствующего о наличии в гидролизате фосфорной кислоты.


  • Гидролиз казеина и открытие в гидролизате белкового компонента и фосфорной кислоты
К 10 каплям гидролизата прибавляют 5 капель 10% раствора едкого натра и по каплям раствор 1% сернокислой меди до появления фиолетового окрашивания - положительная биуретовая проба, что доказывает белковую природу казеина. для открытия фосфорной кислоты снова проводят молибденовую пробу. После образующийся осадок отфильтровывают с помощью бумажного фильтра и к фильтрату, содержащему фосфорномолибденовокислый аммоний, прибавляют 10 капель 2% раствора гидрохинона и оставляют стоять на 5 минут. К содержимому пробирки добавляют 20 капель раствора карбонат сульфита медленно, по каплям, во избежание сильного образования пены. В присутствии фосфорной кислоты постепенно развивается синее окрашивание раствора.

Последнее изменение: Thursday, 10 April 2025, 12:16