Практическая работа ФЕРМЕНТЫ (кафедра биохимии)
Ферменты (энзимы) — белковые катализаторы, ускоряющие химические реакции в живых системах в миллионы раз, действуя в мягких условиях (pH 7,0, 37–40°C, атмосферное давление).
Ключевое отличие от небиологических катализаторов: высокая специфичность (к субстрату, типу реакции) и регулируемость.
СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ
| Тип | Структура | Примеры |
|---|---|---|
| Простые | Только белок (полипептидная цепь) | Пепсин, трипсин, рибонуклеаза |
| Сложные | Апофермент (белок) + Кофактор (небелковая часть) | Многие оксидоредуктазы, трансферазы |
Кофактор может быть:
Ион металла (Zn²⁺, Mg²⁺, Fe²⁺, Cu²⁺) — в карбоангидразе, ДНК-полимеразе
Кофермент — органическая молекула, часто производное витамина (НАД⁺, ФАД, КоА, ТПФ, пиридоксальфосфат)
Активный центр
Активный центр — уникальный участок фермента, образованный функциональными группами аминокислот (обычно 3–12 аминокислот), который:
Связывает субстрат (центр связывания)
Осуществляет катализ (каталитический центр)
Пространственная структура активного центра формируется на уровне третичной структуры фермента.
Алостерический центр
Регуляторный центр, отличный от активного. Связывает эффекторы (активаторы / ингибиторы) → изменяет конформацию активного центра
КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ (МКФ, 6 КЛАССОВ)
| Класс | Катализируемая реакция | Пример фермента | Клинический пример |
|---|---|---|---|
| 1. Оксидоредуктазы | Окисление-восстановление (перенос e⁻, H⁺) | ЛДГ, СДГ, цитохромоксидаза | ЛДГ↑ при инфаркте миокарда |
| 2. Трансферазы | Перенос групп (–CH₃, –PO₄, –NH₂ и др.) | АЛТ, АСТ, киназы | АлАТ↑, АсАТ↑ при поражении печени / сердца |
| 3. Гидролазы | Гидролиз (расщепление с участием H₂O) | Пепсин, трипсин, амилаза, липаза, АЛП (щелочная фосфатаза) | α-Амилаза↑ при панкреатите, АЛП↑ при холестазе |
| 4. Лиазы | Негидролитическое расщепление с образованием двойной связи | Альдолаза, декарбоксилазы | Альдолаза↑ при мышечных дистрофиях |
| 5. Изомеразы | Внутримолекулярная перестройка | Фосфоглюкомутаза, триозофосфатизомераза | Дефицит — гемолитическая анемия |
| 6. Лигазы (синтетазы) | Соединение молекул с затратой АТФ | ПВК-карбоксилаза, ДНК-лигаза | Дефицит лактат-ацидоз |
ФУНКЦИИ ФЕРМЕНТОВ В ОРГАНИЗМЕ
| Функция | Механизм / значение |
|---|---|
| Каталитическая (главная) | Ускорение реакций метаболизма (в 10⁶–10¹² раз) |
| Специфичность | Обеспечивает упорядоченность обмена веществ |
| Регуляторная | Ключевые ферменты — мишени гормонов, метаболитов (аллостерия, фосфорилирование) |
| Сигнальная | Участие в каскадах (киназы, фосфатазы, протеазы в апоптозе) |
| Диагностическая | Изменение активности ферментов в сыворотке — маркеры болезней |
| Фармакологическая мишень | Ингибиторы ферментов — 60% лекарств (статины, НПВС, ингибиторы АПФ) |
- РАБОТА №1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ α-АМИЛАЗЫ
Определить наличие и относительную активность α-амилазы в биологической жидкости (слюна, сыворотка крови, экстракт поджелудочной железы) по скорости гидролиза крахмала.
α-Амилаза гидролизует крахмал до декстринов, мальтозы и глюкозы. Оставшийся негидролизованный крахмал дает синее окрашивание с йодом (реактив Люголя).Чем выше активность амилазы, тем быстрее исчезает синее окрашивание| Реактив | Примечание |
|---|---|
| 0,1–0,5% раствор крахмала (свежеприготовленный) | В физиологическом растворе |
| Реактив Люголя (I₂ в KI) | 0,1 н раствор |
| Слюна (разведенная 1:10 – 1:100) | Фильтрованная |
| Фосфатный буфер pH 6,8 (или 7,0) | Оптимум амилазы |
| Водяная баня (37°C) | |
| Пробирки, пипетки, планшет для капельных проб |
ХОД РАБОТЫ (КЛАССИЧЕСКИЙ ВАРИАНТ)
Вариант А — качественная проба (пробирочная)
В 3 пробирки внести:
Опыт: 2 мл крахмала + 1 мл разведенной слюны
Контроль №1: 2 мл крахмала + 1 мл воды (замена слюны)
Контроль №2: 2 мл воды + 1 мл разведенной слюны (контроль цвета)
Инкубировать 5, 10, 15, 20 мин при 37°C.
Через каждые 5 мин отбирать 1 каплю из каждой пробирки на предметное стекло (или в лунку планшета) и добавлять 1 каплю йода.
Оценить цвет:
Синий / фиолетовый → крахмал есть (амилаза не активна или мало)
Красновато-бурый / желтоватый → крахмал гидролизован до декстринов, амилаза работает
Бесцветный / слабо-желтый → крахмал полностью расщеплен
📌 Время исчезновения синего цвета обратно пропорционально активности амилазы.
Вариант Б — полуколичественный (метод серийных разведений)
Приготовить серию разведений слюны: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 … до 1:1280.
В каждую пробирку: 1 мл крахмала + 1 мл разведения слюны.
Инкубация 10 мин при 37°C.
Добавить 1–2 капли йода.
Титр амилазы — максимальное разведение, при котором исчезает синее окрашивание.
🩺 Норма слюны: титр 1:160 – 1:640.
При остром панкреатите α-амилаза крови повышена, но в слюне — в норме
- РАБОТА №2. ДОКАЗАТЕЛЬСТВО СПЕЦИФИЧНОСТИ α-АМИЛАЗЫ И САХАРАЗЫ
Экспериментально подтвердить субстратную специфичность двух ферментов:
α-Амилаза (гидролизует крахмал, не гидролизует сахарозу)
Сахараза (инвертаза) дрожжей (гидролизует сахарозу, не гидролизует крахмал)
Детекция продуктов в работе:
| Субстрат | Фермент | Продукт гидролиза | Проба Троммера |
|---|---|---|---|
| Крахмал | α-Амилаза | Мальтоза (восстанавливающий дисахарид) | Кирпично-красный |
| Крахмал | Сахараза | — (не гидролизуется) | Отрицательная |
| Сахароза | Сахараза | Глюкоза + фруктоза | Кирпично-красный |
| Сахароза | α-Амилаза | — (не гидролизуется) | Отрицательная |
| Реактив | Примечание |
|---|---|
| 0,5-1% раствор крахмала | Свежеприготовленный |
| 1% раствор сахарозы | |
| α-Амилаза (слюна человека, разведенная 1:10–1:20) | Перед работой профильтровать |
| Экстракт сахаразы (пекарские дрожжи) | См. приготовление ниже |
| 10% раствор NaOH | Для пробы Троммера |
| 1-5% раствор CuSO₄ | Для пробы Троммера |
| Фосфатный буфер pH 6,8 (для амилазы) | Или ацетатный буфер pH 4,5–5,0 для сахаразы |
| Водяная баня (37°C и кипящая) | |
| 8 пробирок, пипетки, спиртовка |
ХОД РАБОТЫ (схема 2×2 — 4 инкубационные пробирки)
Этап 1. Инкубация (30 мин, 37°C)
| Пробирка | Субстрат (1 мл) | Фермент (1 мл) | Буфер (0,5 мл) | Что ожидаем |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Крахмал | α-Амилаза | pH 6,8 | Гидролиз до мальтозы |
| 2 | Крахмал | Сахараза (дрожжи) | pH 5,0 | Гидролиза НЕТ |
| 3 | Сахароза | Сахараза (дрожжи) | pH 5,0 | Гидролиз до глюкозы+фруктозы |
| 4 | Сахароза | α-Амилаза | pH 6,8 | Гидролиза НЕТ |
⚠️ Важно: перед добавлением ферментов убедитесь, что pH среды соответствует оптимуму каждого фермента (для амилазы — слабощелочной/нейтральный, для сахаразы — слабокислый). При несовпадении фермент работать не будет, и вы получите ложноотрицательный результат .
Этап 2. Проведение пробы Троммера (для всех 4 пробирок)
После инкубации отобрать по 1 мл смеси из каждой пробирки в чистые пробирки для постановки пробы.
Добавить 1 мл 10% раствора NaOH → создать щелочную среду.
Добавить 5–10 капель 1-5% раствора CuSO₄ → выпадает голубой осадок Cu(OH)₂.
Нагреть содержимое пробирок до кипения (на спиртовке или в кипящей водяной бане) .
Наблюдать изменение окраски осадка.
| Пробирка | Субстрат + Фермент | Проба Троммера | Цвет осадка | Вывод |
|---|---|---|---|---|
| 1 | Крахмал + α-Амилаза | Положительная | Кирпично-красный Cu₂O | Крахмал гидролизован до мальтозы |
| 2 | Крахмал + Сахараза | Отрицательная | Голубой / синий (Cu(OH)₂) или черный (CuO) | Сахараза не действует на крахмал |
| 3 | Сахароза + Сахараза | Положительная | Кирпично-красный Cu₂O | Сахароза гидролизована до глюкозы+фруктозы |
| 4 | Сахароза + α-Амилаза | Отрицательная | Голубой / синий (Cu(OH)₂) или черный (CuO) | Амилаза не действует на сахарозу |
