Иммуноферментный анализ — метод выявления и количественного определения антигенов (или антител) с использованием:

- Антител, иммобилизованных на твердой фазе (планшет)

- Второго антитела, меченного ферментом (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза)

- Хромогенного субстрата — дает цветную реакцию, интенсивность которой **прямо пропорциональна** концентрации аналита

ОБЩАЯ ИНСТРУКЦИЯ (ПОШАГОВЫЙ АЛГОРИТМ ДЛЯ «СЭНДВИЧ»-ИФА)

1. ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП

1. Приготовить буферные растворы (фосфатно-солевой буфер, pH 7.2–7.4, с Tween-20 — ПБСТ)
2. Разморозить и развести контрольные образцы (калибраторы) и исследуемые сыворотки / плазму 
3. Подготовить 96-луночный полистироловый планшет (сенсибилизирован антителами к искомому антигену)

2. ИНКУБАЦИЯ 1 (СВЯЗЫВАНИЕ АНАЛИТА)

1. Внести в лунки по 100 мкл калибраторов, контрольного образца, исследуемых проб
2. Накрыть планшет адгезивной пленкой 
3. Инкубировать 60 мин при 37°C (или 2 ч при 37°C, зависит от протокола) 

3. ПРОМЫВКА (Автоматическая промывка (промывочное устройство) или ручная):

1.   3–5 раз заполнить лунки промывочным раствором (300 мкл/лунку)
2. Каждый раз полностью удалять жидкость (переворачиванием планшета)
3. После последней промывки — промокнуть планшет о чистое бумажное полотенце/фильтровальную бумагу

1. Внести 100 мкл рабочего разведения конъюгата во все лунки (кроме пустых)
2. Накрыть пленкой
3. Инкубировать 30–60 мин при 37°C

5. ПРОМЫВКА (повторить п. 3 — тщательно, 3–5 раз)

6. ФЕРМЕНТАТИВНАЯ РЕАКЦИЯ (ХРОМОГЕННАЯ)

1. Раствор субстрата (ТМБ — тетраметилбензидин + H₂O₂ для пероксидазы) - внести 100 мкл в лунки, избегая пузырей 
2. Инкубация в темноте при комнатной температуре 5–15 мин до появления синего цвета в калибраторах 
3. Стоп-реагент (1 M H₂SO₄ или HCl) - внести 100 мкл в том же порядке, что и субстрат 

7. ИЗМЕРЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ

1. Использовать спектрофотометр для планшетов (длина волны: 450 нм для ТМБ)
2. Референс-волна(обычно 620–650 нм) — для фона планшета