Практическое занятие МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ (кафедра биохимии)
Липиды — группа органических веществ, нерастворимых в воде, но растворимых в неполярных растворителях (эфир, хлороформ, бензол).
Основные классы липидов (важные для пищеварения):
| Класс | Примеры | Значение |
|---|---|---|
| Простые липиды | Триацилглицерины (ТАГ, нейтральные жиры) | Основные пищевые жиры, источник энергии |
| Сложные липиды | Фосфолипиды (лецитин), гликолипиды | Структурные компоненты мембран, эмульгаторы |
| Стероиды | Холестерин, желчные кислоты | Предшественники гормонов, участие в эмульгировании |
| Жирные кислоты (ЖК) | Насыщенные, ненасыщенные | Энергия, синтез липидов |
ПЕРЕВАРИВАНИЕ ЛИПИДОВ
| Этап | Локализация | Факторы / Ферменты | Результат |
|---|---|---|---|
| 1. Эмульгирование | Рот (у грудных), желудок, ДПК | Желчные кислоты, фосфолипиды, перистальтика | Крупные капли жира → мелкие капли (увеличение поверхности) |
| 2. Гидролиз | ДПК, тонкая кишка | Панкреатическая липаза + колипаза, фосфолипаза А₂ | ТАГ → 2-МГ + ЖК; фосфолипиды → лизофосфолипиды + ЖК |
| 3. Мицеллообразование | Просвет кишки | Желчные кислоты + 2-МГ + ЖК + холестерин | Смешанные мицеллы (транспорт к щеточной кайме) |
| 4. Всасывание | Энтероциты | Пассивная диффузия, транспортные белки | ЖК + 2-МГ → ресинтез ТАГ → хиломикроны |
| 5. Транспорт в крови | Лимфа → кровь | Альбумин (для ЖК), липопротеины | Хиломикроны (экзогенные жиры), альбумин-ЖК |
Ключевые моменты:
Желчные кислоты — не ферменты, а эмульгаторы и активаторы липазы.
Липаза активна на границе раздела фаз «жир-вода».
Альбумин — транспорт свободных ЖК в крови.
РАБОТА №1. ЭМУЛЬГИРОВАНИЕ ЖИРОВ РАЗНЫМИ ЭМУЛЬГАТОРАМИ
Сравнить эффективность различных эмульгаторов (желчь, мыло, лецитин, синтетические детергенты) в образовании стабильной эмульсии жира в воде.
Эмульсия — дисперсная система «жир в воде» (масло/вода).
Эмульгатор — поверхностно-активное вещество (ПАВ), снижает поверхностное натяжение на границе раздела фаз, обволакивает капли жира и предотвращает их слияние (коалесценцию).
Стабильность эмульсии оценивают визуально (расслоение, высота слоя эмульсии) или с помощью красителей (судан III — окрашивает жир).
| Реактив | Примечание |
|---|---|
| Растительное масло (оливковое, подсолнечное) | Модельный жир |
| Дистиллированная вода | Контроль (без эмульгатора) |
| 1% раствор желчи (бычьей или медицинской) | Эмульгатор №1 |
| 1% раствор мыла (натриевая соль ЖК) | Эмульгатор №2 |
| 1% раствор лецитина (яичный желток, разведенный 1:10) | Эмульгатор №3 |
| 0,1% раствор Твин-80 (синтетический ПАВ) | Эмульгатор №4 |
| Пробирки (5 шт.), штатив, пипетки, секундомер |
ХОД РАБОТЫ
| Пробирка | Масло (мл) | Вода (мл) | Эмульгатор (мл) |
|---|---|---|---|
| 1 (контроль) | 2 | 2 | — (вода 2 мл) |
| 2 | 2 | 2 | Желчь 2 мл |
| 3 | 2 | 2 | Мыло 2 мл |
| 4 | 2 | 2 | Лецитин 2 мл |
| 5 | 2 | 2 | Твин-80 2 мл |
Запустить секундомер.
Наблюдать:
Начальная эмульсия (мутная, однородная)
Начало расслоения (появление прозрачного слоя воды снизу)
Время полного расслоения (или оценить через 5, 10, 15 мин)
ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
| Пробирка | Эмульгатор | Стабильность | Почему? |
|---|---|---|---|
| 1 | Нет | 0 (мгновенное расслоение) | Без ПАВ жир сливается |
| 2 | Желчь | +++ (высокая) | Желчные кислоты — мощные природные эмульгаторы (критическая концентрация мицеллообразования низкая) |
| 3 | Мыло | ++ (средняя) | Мыло — хороший эмульгатор, но может выпадать в осадок в кислой среде (в нейтральной — работает) |
| 4 | Лецитин | ++ (средняя) | Фосфолипид, природный эмульгатор, хуже желчи |
| 5 | Твин-80 | +++ (высокая) | Синтетическое ПАВ, очень эффективно |
Вывод: Наиболее эффективный эмульгатор — желчь (и синтетический Твин-80). Желчь обеспечивает образование мелкодисперсной стабильной эмульсии, необходимой для действия липазы.
РАБОТА №2. РОЛЬ ЖЕЛЧНЫХ КИСЛОТ В АКТИВНОСТИ ЛИПАЗЫ (ТИТРОВАНИЕ)
Количественно доказать, что панкреатическая липаза гидролизует триацилглицерины только в присутствии желчных кислот, которые эмульгируют жир и активируют фермент (через колипазу).
Липаза гидролизует ТАГ до свободных жирных кислот (ЖК) и моноглицеридов.
Освободившиеся ЖК титруют щелочью (NaOH).
Количество ЖК (в ммоль) прямо пропорционально активности липазы.
Сравнивают гидролиз с желчью и без желчи.
| Реактив | Примечание |
|---|---|
| 10% эмульсия оливкового масла | Субстрат (ТАГ) |
| Панкреатическая липаза (коммерческая или экстракт поджелудочной железы) | Раствор в буфере |
| 1% раствор желчи (или желчных кислот) | Активатор |
| Фосфатный буфер pH 8,0 | Оптимум липазы |
| 0,05 н NaOH | Для титрования |
| 1% спиртовой раствор фенолфталеина | Индикатор |
| Водяная баня 37°C | |
| 2 конические колбы, бюретка, пипетки |
ХОД РАБОТЫ
Этап 1. Инкубация (30 мин, 37°C)
| Колба | Эмульсия масла (мл) | Липаза (мл) | Желчь (мл) | Буфер (мл) | H₂O (мл) |
|---|---|---|---|---|---|
| 1 (опыт) | 5 | 1 | 1 | 3 | — |
| 2 (контроль) | 5 | 1 | — | 3 | 1 |
Вместо желчи в контроль добавляют воду.
Этап 2. Титрование образовавшихся ЖК
После инкубации добавить в каждую колбу 2–3 капли фенолфталеина.
Титровать 0,05 н NaOH до появления устойчивого розового окрашивания.
Записать объем NaOH (V₁ и V₂) в мл.
| Колба | V(NaOH), мл | Количество ЖК (усл. ед.) | Вывод |
|---|---|---|---|
| 1 (+желчь) | V₁ = 8,2 мл | Высокое | Липаза активна |
| 2 (−желчь) | V₂ = 0,5 мл | Низкое (фон) | Липаза неактивна без эмульгирования |
Формула для расчета количества ЖК:
(в ммоль, если V в мл, а C в моль/л, то ).
ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
| Колба | Условия | Объем титранта (0,05 н NaOH) | Свободные ЖК (ммоль) |
|---|---|---|---|
| 1 | Масло + липаза + желчь | 8,0–10,0 мл | 0,4–0,5 |
| 2 | Масло + липаза без желчи | 0,2–1,0 мл | 0,01–0,05 |
Вывод: Желчные кислоты необходимы для проявления активности панкреатической липазы, так как они эмульгируют жир и обеспечивают доступ фермента к субстрату (через колипазу).
РАБОТА №3. РОЛЬ АЛЬБУМИНА В ТРАНСПОРТЕ СВОБОДНЫХ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Продемонстрировать, что альбумин сыворотки крови связывает свободные жирные кислоты (ЖК), предотвращая их токсическое действие и обеспечивая транспорт в крови.
Свободные ЖК в воде образуют мицеллы, а при высоких концентрациях — пленку на поверхности.
Альбумин связывает ЖК в комплекс альбумин-ЖК, который растворим в воде.
Образование комплекса можно оценить:
По исчезновению мути (ЖК в виде капель → растворимый комплекс)
По изменению электрофоретической подвижности (демонстрационно)
По уменьшению поверхностного натяжения (с помощью капилляра)
Визуально с красителем (например, Нильский голубой или Судан)
В учебной лаборатории чаще используют упрощенную модель: смешивают олеиновую кислоту (ЖК) с раствором альбумина и наблюдают просветление.
| Реактив | Примечание |
|---|---|
| 1% раствор олеиновой кислоты (или смеси ЖК) | В этаноле (для растворения) |
| 5% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) | В фосфатном буфере pH 7,4 |
| Фосфатный буфер pH 7,4 | |
| 0,9% NaCl (физраствор) | Контроль |
| Пробирки (3 шт.), встряхиватель, спектрофотометр (опционально) |
ХОД РАБОТЫ (упрощенный визуальный вариант)
Приготовить 3 пробирки:
| Пробирка | Олеиновая кислота (капли) | Альбумин (мл) | Физраствор (мл) |
|---|---|---|---|
| 1 (опыт) | 2 капли | 2 мл | — |
| 2 (контроль) | 2 капли | — | 2 мл |
| 3 (контроль альбумина) | — | 2 мл | — |
Энергично встряхнуть каждую пробирку 10–15 секунд.
Наблюдать:
Пробирка 1 (альбумин + ЖК): мутная вначале, но через 1–2 минуты становится прозрачной или слегка опалесцирует.
Пробирка 2 (физраствор + ЖК): стойкая муть или капли жира на поверхности.
Пробирка 3 (альбумин без ЖК): прозрачный.
Вывод: Альбумин является главным транспортным белком для свободных жирных кислот в крови. Связывая ЖК, он предотвращает их токсическое действие (повреждение мембран, инактивацию ферментов) и доставляет их к тканям-мишеням.
