Практическое занятие МЕТАБОЛИЗМ БЕЛКОВ (кафедра биохимии)
Изучить процессы ферментативного гидролиза белков в желудке, освоить методы оценки кислотообразующей и протеолитической функции желудка, а также диагностики патологических состояний (ацидизм, гипо- и анацидные состояния, молочнокислое брожение).
РАБОТА №1. ПЕРЕВАРИВАНИЕ БЕЛКА ПЕПСИНОМ
Наблюдать гидролиз белка под действием пепсина в условиях, приближенных к желудочным (pH ~1,5–2,0, t=37–40°C), и доказать необходимость кислотности для активации пепсиногена и работы пепсина.
Пепсин (активная форма) гидролизует белки до полипептидов, пептонов и небольшого количества аминокислот.
О наличии гидролиза судят по исчезновению белкового осадка (белок переходит в раствор) или по биуретовой реакции (интенсивность фиолетового окрашивания уменьшается при расщеплении белков до пептидов разной длины).
В работе используют фиксированный белок (сваренный яичный белок) — он не растворяется, но разбухает и переваривается пепсином, что визуально хорошо заметно.
| Реактив / Материал | Примечание |
|---|---|
| 0,2–0,5% раствор пепсина | Свежеприготовленный |
| 0,2% HCl | Создание кислой среды (оптимум пепсина) |
| Дистиллированная вода | Для контроля (нейтральная среда) |
| Сваренный «вкрутую» яичный белок | Нарезать мелкими кубиками (3×3 мм) |
| Водяная баня (37–40°C) | |
| Пробирки (4 шт.), штатив, пипетки |
ХОД РАБОТЫ
В 4 пробирки внести:
Пробирка Белок (кусочек) Пепсин HCl H₂O 1 (опыт) + 2 мл 2 мл — 2 (контроль) + — 2 мл 2 мл 3 (контроль) + 2 мл — 2 мл 4 (контроль) + — — 4 мл Поместить пробирки в водяную баню при 37–40°C на 30–60 минут.
Наблюдать визуально состояние кусочков белка: размягчение, просветление, исчезновение.
Оценить результат по шкале:
| Степень переваривания | Визуально |
|---|---|
| +++ (полное) | Кусочек исчез, жидкость мутная |
| ++ (значительное) | Кусочек сильно размягчен, края размыты |
| + (слабое) | Кусочек набух, края слегка размыты |
| — (отсутствует) | Кусочек без изменений, жидкость прозрачная |
ОЖИДАЕМЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ
| Пробирка | Результат | Объяснение |
|---|---|---|
| 1 (пепсин + HCl) | +++ (полное переваривание) | Пепсин активен при pH 1,5–2,0 |
| 2 (без пепсина, с HCl) | — | Нет фермента |
| 3 (пепсин, без HCl) | — или + | Пепсин не активирован (пепсиноген не перешел в пепсин) или неактивен в нейтральной среде |
| 4 (вода) | — | Нет ни фермента, ни кислоты |
Вывод: Для переваривания белка пепсином необходимы кислая среда (HCl) и активный фермент.
РАБОТА №2. ТИТРОВАНИЕ КИСЛОТ ЖЕЛУДОЧНОГО СОДЕРЖИМОГО
Количественно определить свободную и связанную HCl в желудочном соке методом титрования с двумя индикаторами.
Сначала титруют свободную HCl с индикатором диметиламиноазобензолом (переход от красного к желтому).
Затем к тому же раствору добавляют фенолфталеин и продолжают титрование до розового цвета — титруется связанная HCl + кислые валентности.
Общая кислотность = сумма объемов щелочи по обоим индикаторам.
| Реактив | Примечание |
|---|---|
| Желудочный сок (нативный или модель) | Фильтрованный |
| 0,1 н раствор NaOH | Для титрования |
| 0,5% спиртовой раствор диметиламиноазобензола | Индикатор на свободную HCl |
| 1% спиртовой раствор фенолфталеина | Индикатор на общую кислотность |
| Бюретка, колбы (2 шт.), пипетки, штатив |
ХОД РАБОТЫ
В коническую колбу отмерить 5–10 мл желудочного содержимого.
Добавить 2 капли диметиламиноазобензола → цвет красный.
Титровать 0,1 н NaOH до перехода в желтый → фиксировать объем (пошел на свободную HCl).
Добавить 2 капли фенолфталеина.
Продолжить титрование тем же раствором NaOH до появления розового окрашивания → фиксировать общий объем (от начала титрования).
Объем на связанную HCl + остальное = .
ПРИМЕР РАСЧЕТА
Взято 5 мл сока.
мл (свободная HCl)
мл (общий до розового)
| Показатель | Расчет | Значение |
|---|---|---|
| Свободная HCl | 2,0 × 20 = 40 ТЕ | норма |
| Связанная HCl | (3,5 – 2,0) × 20 = 30 ТЕ | норма |
| Общая кислотность | 3,5 × 20 = 70 ТЕ | верхняя граница нормы |
Нормальные показатели желудочного сока (натощак / базальная секреция):
| Показатель | Норма (ммоль/л или ТЕ) |
|---|---|
| Свободная HCl | 20–40 |
| Общая кислотность | 40–60 |
Клиническая интерпретация:
| Состояние | Свободная HCl |
|---|---|
| Нормацидность | 20–40 |
| Гиперацидность | >40 |
| Гипоацидность | 10–20 |
| Анацидность | 0–10 (свободная HCl отсутствует) |
РАБОТА №3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ В ЖЕЛУДОЧНОМ СОДЕРЖИМОМ
Выявить наличие молочной кислоты в желудочном содержимом — маркера патологических процессов (ахилия, рак желудка, застой содержимого, молочнокислое брожение).
Молочная кислота при взаимодействии с фенолом и FeCl₃ (хлорид железа(III)) дает желто-зеленое окрашивание (соединение железа с лактатом и фенолом).
Соляная кислота мешает реакции, поэтому ее нейтрализуют перед анализом.
| Реактив | Примечание |
|---|---|
| Желудочное содержимое (фильтрованное) | |
| 1% раствор фенола (карболовая кислота) | Свежеприготовленный |
| 10% раствор FeCl₃ | |
| 10% раствор NaOH | Для нейтрализации HCl |
ХОД РАБОТЫ
В пробирку внести 2–3 мл желудочного сока.
Добавить по каплям 10% NaOH до нейтральной или слабощелочной реакции (контролировать по лакмусу) — нейтрализовать свободную HCl, которая мешает реакции.
Добавить 2–3 капли 1% раствора фенола.
Добавить 1–2 капли 10% раствора FeCl₃.
Наблюдать окрашивание.
| Окрашивание | Заключение |
|---|---|
| Желто-зеленое | Молочная кислота присутствует |
| Отсутствие (желтый, бурый, бесцветный) | Молочная кислота отсутствует (норма) |
Клиническое значение: молочная кислота в желудке в норме не определяется. Она появляется при:
Ахилии (отсутствие HCl)
Раке желудка (облитерация желез, застой, брожение)
Стенозе привратника (застой пищи, брожение бактериями)
Гипо- и анацидных состояниях (разрастание молочнокислых бактерий)
